PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA

Abstract in English:

Nerium oleander is an ornamental cardiotoxic plant found in tropical and subtropical areas of the World. Its toxicity is related to the content of cardioactive glycosides, mainly oleandrin, found throughout the plant. The present study aimed to describe a new and improved method for oleandrin detection in tissue samples. The determination of oleandrin was made after extraction with a modified QuEChERS technique and measurement by UFLC-MS/MS. A total of 36 guinea pigs (Cavia porcellus) were distributed into 3 groups (n=12): control group that received only water orally (CON), and two treated groups that received hydroalcoholic oleander extract at doses of 150mg.kg-1 (OLE 150) and 300mg.kg-1 (OLE 300) in single oral dose. After three hours, fragments of heart, kidneys, liver and brain were collected for determination of oleandrin levels. The extraction and chromatographic procedures were effective for oleandrin detection and quantification in tissues, with retention time of 1.2 min and detection limit of 0.001µg g-1. The chromatographic analysis of treated guinea pigs indicated that oleandrin is distributed equally among the analyzed tissues. The developed methodology is a reliable, effective and rapid form of diagnosis of N. oleander poisoning based on necropsy tissue samples.

• Oleander Nerium oleander cardenolides diagnostic testing liquid chromatography mass spectrometry guinea pigs toxicoses

Abstract in Portuguese:

Nerium oleander é uma planta cardiotóxica ornamental encontrada em áreas tropicais e subtropicais do mundo. Sua toxicidade é relacionada á presença de glicosídeos cardioativos, principalmente a oleandrina, encontrada em toda a planta. O presente estudo objetiva descrever um novo e aprimorado método para detecção da oleandrina em amostras de tecido. A determinação da oleandrina foi feita após extração utilizando técnica modificada de QuEChERS e mensuração por UFLC-MS/MS. Um total de 36 cobaios (Cavia porcellus) foi distribuído em três grupos (n=12): grupo controle que recebeu apenas água por via oral (CON), e dois grupos tratados que receberam extrato hidroalcóolico de oleander nas doses de 150mg.kg-1 (OLE 150) e 300mg.kg-1 (OLE 300) em uma única dose oral. Após três horas, fragmentos do coração, rins, fígado e cérebro foram coletados para determinação dos níveis de oleandrina. A extração e procedimentos cromatográficos foram eficientes na detecção e quantificação da oleandrina nos tecidos, com tempo de retenção de 1,2min e limite de detecção de 0,001µg g-1. A análise cromatográfica dos animais tratados indicou que a oleandrina é distribuída de forma equalizada pelos tecidos analisados. A metodologia desenvolvida representa uma forma de diagnóstica segura, efetiva e rápida da intoxicação por N. oleander a partir de amostras de tecidos de necropsia.

• Oleander Nerium olender cardenolídeos teste diagnóstico cromatografia líquida espectrometria de massa cobaias toxicoses

Abstract in English:

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has been shown to be an alternative method for identification of bacteria via their protein profile spectra, being able to identify bacteria at the genus, species and even at subspecies level. With the aim of large-scale identification of pathogens causing mastitis by this platform, a total of 305 isolates of bacteria identified from cows with subclinical mastitis were analyzed by conventional microbiological culture (MC) as well as by MALDI-TOF MS coupled with Biotyper data processing. Approximately 89% of the identifications performed by MALDI-TOF MS were consistent with results obtained by MC. From the remaining isolates (11%), 6.3% of isolates were classified as misidentified (discordance for both genus and species level), and 4.7% showed identification agreement at the genus level but not at the species level, being classified as unidentified at species level. The disagreement results were mostly associated with identification of Streptococcus and Enterococcus species probably due to the narrow phenotypic similarity between these two genera. These disagreement results suggest that biochemical assays might be prone to identification errors and, MALDI-TOF MS therefore may be an alternative to overcome incorrect species-specific identification. Standard microbiological methods for bovine mastitis diagnosis are time consuming, laborious and prone to errors for some bacteria genera. In our study, we showed that MALDI-TOF MS coupled with Biotyper may be an alternative method for large-scale identification of bacteria isolated from milk samples compared to classical microbiological routine protocols.

• Rapid identification bovine mastitis pathogens MALDI-TOF MS Mass Spectrometry protein fingerprinting subclinical mastitis cattle bacterioses

Abstract in Portuguese:

A espectrometria de massas (MALDI-TOF MS) tem mostrado ser um método alternativo para a identificação de bactérias, sendo capaz de identificar as bactérias causadoras de mastite em gênero, espécie ou até mesmo subespécie. Com o objetivo de identificar os patógenos causadores de mastite em grande-escala por esta plataforma, um total de 305 isolados bacterianos oriundos de vacas com mastite subclínica foram analisados pela cultura microbiológica convencional (CM) e pela MALDI-TOF MS acoplada ao software Biotyper. Aproximadamente 89% das identificações realizadas pela MALDI-TOF MS foram consistentes com os resultados obtidos pela CM. Do restante de isolados bacterianos (11%), 6,3% foram classificados como identificação errônea (discordância de gênero e espécie), e 4,7% apresentaram concordância de gênero, mas discordância da espécie. Os resultados que apresentaram divergência estavam mais associados com a identificação das espécies de Streptococcus spp. e Enterococcus spp. devido à similaridade fenotípica entre os dois gêneros. Estes resultados divergentes sugerem que os ensaios bioquímicos podem ser propensos a erros de identificação, por isso a MALDI-TOF MS pode ser considerada um método alternativo para superar os erros de identificação da CM. A cultura microbiológica padrão e os ensaios bioquímicos utilizados na identificação de agentes causadores de mastite são demorados, trabalhosos e propensos a erros quando utilizados na identificação em nível de espécie. No presente estudo, demonstramos que a MALDI-TOF MS acoplada ao software Biotyper pode ser considerada um método alternativo de identificação de bactérias causadoras de mastite em grande-escala quando comparado com a cultura microbiológica convencional.

• Identificação rápida mastite espectrometria de massas MALDI-TOF MS perfil proteico mastite subclínica bovinos bacterioses

Abstract in English:

ABSTRACT.- Bier D., Tutija J.F., Pasquatti T.N., Oliveira T.L., Araújo F.R. & Verbisck N.V. 2017. [MALDI–TOF mass spectrometry identification of Salmonella spp. and Escherichia coli isolated from bovine carcasses.] Identificação por espectrometria de massa MALDI-TOF de Salmonella spp. e Escherichia coli isolados de carcaças bovinas. Pesquisa Veterinária Brasileira 37(12):1373-1379. Setor de Sanidade Animal, Embrapa Gado de Corte, Av. Rádio Maia 830, Zona Rural, Campo Grande, MS 79106-550, Brazil. E-mail: newton.verbisck@embrapa.br The aim of this study was to introduce matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) time-of-flight (TOF) mass spectrometry to improve the traditional microbiological method for the detection of Salmonella spp. and Escherichia coli in beef carcasses. Two hundred seventy samples from 90 beef carcasses were evaluated. The methodologies described in ISO 6579:2002 and in the Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods were used for Salmonella spp. and E. coli isolation, respectively. MALDI-TOF analysis were performed on tryptone soya broth suspension isolates or directly from nutrient agar colonies, from the positive, inconclusive or negative biochemically tested samples for Salmonella and E. coli. Mass profiles were acquired on an Autoflex III SmartBeam MALDI-TOF mass spectrometer and the raw spectra were processed using the MALDI Biotyper software (Bruker Daltonics). According to the preliminary identification based on colony morphology and the biochemical reactions, seven isolates were positive for Salmonella spp. Through MALDI Biotyper these seven isolates were also classified as belonging to the genus Salmonella and further identified as S. enterica. Four isolates showing unusual phenotypic characteristics and inconclusive results in biochemical tests for Salmonella were identified as belonging to Citrobacter and Proteus genera after MALDI analysis. Regarding Escherichia coli, 37 were positive for species biochemical testing which MALDI Biotyper confirmed. MALDI-TOF methodology allowed rapid Salmonella spp. and E. coli identity confirmation and may be used to detect these microrganisms within bacterial isolates from beef carcasses.

• Salmonella spp. Escherichia coli enterobacteria enterobactérias

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Bier D., Tutija J.F., Pasquatti T.N., Oliveira T.L., Araújo F.R. & Verbisck N.V. 2017. [MALDI–TOF mass spectrometry identification of Salmonella spp. and Escherichia coli isolated from bovine carcasses.] Identificação por espectrometria de massa MALDI-TOF de Salmonella spp. e Escherichia coli isolados de carcaças bovinas. Pesquisa Veterinária Brasileira 37(12):1373-1379. Setor de Sanidade Animal, Embrapa Gado de Corte, Av. Rádio Maia 830, Zona Rural, Campo Grande, MS 79106-550, Brazil. E-mail: newton.verbisck@embrapa.br O objetivo deste trabalho foi introduzir a técnica de espectrometria de massa com fonte de ionização e dessorção a laser assistida por matriz e analisador de tempo-de-voo (MALDI-TOF) para incrementar o método tradicional microbiológico na detecção de Salmonella spp. e Escherichia coli em carcaças bovinas. Foram avaliadas 270 amostras de 90 carcaças de bovinos. Para isolamento de Salmonella spp. e E. coli, foram utilizadas, respectivamente, as metodologias descritas na ISO 6579:2002 e no Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. As análises por MALDI-TOF foram realizadas a partir de isolados cultivados em ágar nutriente ou em caldo triptona de soja, provenientes das amostras com características bioquímicas positivas (n=7), inconclusivas (n=4) e negativas (n=85) para Salmonella spp. e bioquímicas positivas (n=37) e negativas (n=85) para E. coli. Os perfis de massas foram adquiridos com o espectrômetro de massas MALDI-TOF Autoflex III SmartBeam e os espectros brutos foram processados usando o programa MALDI Biotyper (Bruker Daltonics). De acordo com a identificação preliminar, com base na morfologia das colônias e nas reações bioquímicas, sete isolados foram considerados positivos para Salmonella spp. Através do MALDI Biotyper, esses sete isolados foram classificados como pertencentes ao gênero Salmonella e, além disso, identificados como S. enterica. Quatro isolados que apresentaram características fenotípicas não usuais e resultados inconclusivos nos testes bioquímicos para Salmonella foram identificados como pertencentes aos gêneros Citrobacter e Proteus após análise por MALDI. Para E. coli, 37 amostras foram positivas pelos testes bioquímicos da espécie, o que foi confirmado por MALDI Biotyper. A metodologia MALDI-TOF permitiu a rápida confirmação da identidade de Salmonella spp. e E. coli, podendo ser utilizada para detecção desses microrganismos em isolados bacterianos de carcaças bovinas.